|
細胞量不夠？細胞碎片太多？
導致實驗一次次重復？盤他！
教你如何把細胞周期的數據
變的更加漂亮，準確！
細胞周期簡介
流式細胞儀是檢測細胞周期最常用的方法，細胞周期是指細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的時間，它代表著生命從一代向下一代傳遞的連續過程。
主要分為以下2大過程：
▲分裂間期：間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）；
▲分裂期M期：細胞分裂期，指細胞分裂開始到結束。
實驗步驟
1. 細胞培養：取對數生長期的細胞，按1×106cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種于6孔板內，進行所需的處理（比如加入藥物），特定時間后終止培養，進行下一步的實驗。
2. 細胞固定：800rpm離心5min，收集細胞沉淀，棄上清，用預冷PBS洗滌兩次，加入預冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 細胞染色：800rpm離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌一次，加入400uL溴化乙錠（PI，50ug/mL），100ulRNaseA（100ug/mL ），4℃避光孵育60min。
4. 流式分析：以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數2~3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。注：上機前要以50um尼龍網膜或35um細胞過濾器過濾細胞！因為PI具有很強的粘附性，容易使細胞聚團！
常見問題解答
1.是否可以直接用乙醇固定細胞？
不可以，直接70~75%乙醇加入很容易導致細胞聚團現象，很難重懸成單細胞，影響固定效果，甚至容易導致固定后無細胞沉淀的現象。正確做法是：待細胞充分分散成單細胞后，緩慢地滴入無水乙醇中，使其終濃度為70~75%乙醇。
2.細胞量過少，無法獲得數據結果？
▲首先，要保證收集足夠的細胞樣品（個人經驗至少收集100萬左右）；如果藥物處理后細胞死亡過多，應該降低藥物濃度；
▲其次，固定細胞時先用預冷的PBS重懸細胞，再逐滴滴入無水乙醇中；
細胞清洗時，不可過度吹打細胞，以防產生過多的細胞碎片；
▲最后，盡量采用尖底的離心管和水平的離心機，離心后盡量用移液槍吸走上清，不要傾倒，殘留一點，不要吸完；
3.什么樣的數據結果可以用？
▲G2/M期細胞的DNA含量是G1期的2倍，在直方圖上形成一個2倍于G1信號峰的高斯峰；
▲CV(變異系數)表示峰的寬度，CV值越小，峰形越好，最好是在5%左右，一般小于10%也被認可。
▲RCS最好是在1~3，高于5則不被認可。RCS高，說明數據的分布和軟件所建立模型的預期值的差別比較大，可能由于處理細胞的時候RNA酶消化不好，或者是PI的濃度不佳造成的。
4.如何提高分辨率和精確度？
變異系數（Coefficient of Variation，CV值）反映G0/G1峰分辨率和精確度。而樣品CV值為樣品固有，與樣本制備過程中細胞質量有關。細胞碎片越少、細胞聚團越少、RNA酶消化越充分，可以減少樣本的CV值，提高G0/G1峰分辨率和精確度。
|
